食品微生物微生物培養(yǎng)基制作技術(shù)實(shí)訓(xùn)

1. 實(shí)驗(yàn)器材

天平、稱量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、錐形瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管桶、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿桶、玻璃棒、燒杯、試管架、剪刀、棉花、線繩、牛皮紙或報(bào)紙、紗布、乳膠管、電爐、滅菌鍋、干燥箱。

2. 實(shí)驗(yàn)試劑

蛋白胨、牛肉膏、NaCl、瓊脂、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、馬鈴薯、豆芽汁、磷酸銨、K2HPO4、NaNO3、KCL、MgSO4、FeSO4、1 mol/L NaOH溶液、 1 mol/L HCL溶液等。

3. 實(shí)驗(yàn)流程

選擇原料→計(jì)算→稱重→混合溶解→調(diào)整pH→（加指示劑）→溶化瓊脂→過濾→分裝→加塞→包扎→滅菌→鑒定→保存。

4. 實(shí)驗(yàn)步驟

1) 原料的選擇、計(jì)算與稱量：根據(jù)培養(yǎng)基的配方，計(jì)算所配培養(yǎng)基需要原料的準(zhǔn)確數(shù)量，選擇不同精密的稱量工具進(jìn)行原料的稱取，常見的稱量工具有托盤天平、電子天平、分析天平等。 一般情況下，原料的稱量不需要很高精密度的儀器，用電子天平就可以了。

2) 混合溶解：將稱量好的各種原料根據(jù)要求將先后放入燒杯或其它容器中進(jìn)行混合溶解，注意先加少于總量的水，在電爐上加熱溶解，溶解時(shí)需不斷攪拌。固體培養(yǎng)基需要最后加入瓊脂，邊加邊攪拌，待完全溶解后，補(bǔ)足所失水分。

3) 調(diào)整pH 值：用pH 試紙或 pH 計(jì)測定培養(yǎng)基 的pH，常用1moL/L NaOH溶液 或 1 moL/L HCL溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH 到所需范圍。注意等培養(yǎng)基稍降低一些溫度后進(jìn)行調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值；在調(diào)節(jié)pH時(shí)，要逐滴加入酸堿調(diào)節(jié)劑，并隨時(shí)測定，以免調(diào)過再回調(diào)，否則會(huì)增加培養(yǎng)基中的鈉、氯等離子的含量。

4) 加指示劑：對(duì)某些培養(yǎng)基，按要求加入一定量指示劑。這時(shí)也需要注意培養(yǎng)基溫度不要太高。也可以將指示劑單獨(dú)滅菌，在用前，按需要比例加入溶解后的培養(yǎng)基，搖勻備用。

5) 溶化瓊脂：固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全熔化后才能停止攪拌，并補(bǔ)足水分（水需預(yù)熱）。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。

6) 過濾：培養(yǎng)基配制后一般都有沉渣或渾濁出現(xiàn)，需要過濾方可使用，可用濾紙或2～4層的紗布過濾。固體培養(yǎng)基最好趁熱用紗布過濾。

7) 分裝：將過濾后的培養(yǎng)基根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分裝于不同容器內(nèi)，注意各容器的分裝量要求。三角燒瓶：不超過容量的1/2 ，高度的1/3 。試管：液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基約裝試管容量的1/4 ～ 1/3 ；斜面培養(yǎng)基約裝試管容量的1/5 。

8) 加塞：由紗布包棉花做成的棉塞（形如未打開傘之幼嫩蘑菇，大小和松緊適中）和現(xiàn)在的硅膠塞。因?yàn)楣枘z塞一般不透氣，在滅菌的升溫和降溫過程中，試管內(nèi)外壓力會(huì)有差異，當(dāng)管內(nèi)壓力大于管外壓力時(shí)可能使塞子飛出或試管爆裂。為了之后的滅菌過程順利，我們一般選用棉花塞。棉花塞透氣，能保持內(nèi)外壓平衡，同時(shí)又能阻止細(xì)菌進(jìn)入。棉花塞制作方法參見圖3-1。

①棉塞制作方法一

②棉塞制作方法二

圖3-1 棉塞制作方法（兩種方法）

培養(yǎng)基分裝后，在試管口或三角瓶口塞上棉塞，如培養(yǎng)基在短期內(nèi)使用，也可在試管口套上試管帽。棉塞的作用有：一是阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)，防止引起培養(yǎng)基的污染。二是保證培養(yǎng)時(shí)有良好的通氣性能，因此棉塞的好壞對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將有所影響。棉塞一般不宜用脫脂棉做，因?yàn)樗孜儩?，容易造成污染，加塞時(shí)，棉塞總長的 2/3 在口內(nèi)，1/3 在口外。

9) 包扎標(biāo)記：加好塞后，在棉塞外再包上一層牛皮紙，以防滅菌時(shí)冷凝水直接沾濕棉塞及存放中防止塵埃等污染。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)先將試管成捆扎牢，上面包一層牛皮紙?jiān)僭o，然后貼上標(biāo)簽，標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、日期及組號(hào)后進(jìn)行滅菌。

10) 滅菌：最常用的是高壓蒸汽滅菌法，將待滅菌的培養(yǎng)基放入加壓滅菌鍋內(nèi)，培養(yǎng)基滅菌時(shí)的溫度和滅菌時(shí)間，按照不同種類的培養(yǎng)基的規(guī)定進(jìn)行操作。以保證滅菌效果和不損壞培養(yǎng)基的必要成分。

一般培養(yǎng)基配制說明上推薦的滅菌時(shí)間，是假定所滅菌的培養(yǎng)基的體積為1L或1L以下。如果需滅菌培養(yǎng)基的體積增加，時(shí)間延長，溫度不變。含有碳水化合物的培養(yǎng)基在高壓蒸汽滅菌時(shí)，溫度不能超過116℃～l18℃，防止出現(xiàn)碳水化合物的碳化水解。需要注意過度滅菌的培養(yǎng)基可能出現(xiàn)以下問題：培養(yǎng)基碳化或變黑；出現(xiàn)非典型的沉淀；降低瓊脂的凝結(jié)能力；改變正確的pH；失去營養(yǎng)價(jià)值；失去選擇性或鑒別性的能力。

高壓蒸汽滅菌鍋操作步驟如下：①加水：先將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜注意水量一定要加足，否則容易造成事故。

②裝料：放回內(nèi)層滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而打濕棉塞。

③加蓋密封：將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，切勿漏氣，否則達(dá)不到徹底滅菌的目的。

④排氣升壓：接通電源進(jìn)行加熱，并同時(shí)打開排氣闕，使水沸騰以排出鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后(約1Omin)，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制電源，維持壓力至所需時(shí)間。

⑤降壓：達(dá)到規(guī)定的滅菌時(shí)間后，切斷電源，讓其自然降壓冷卻。

⑥取料：待壓力完全降至“0”時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，打開鍋蓋，取出滅菌物品。如果壓力未降到“0”時(shí)，打開排氣閥，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出瓶口或試管，造成棉塞沾污培養(yǎng)基而易發(fā)生污染。

⑦倒水：滅菌鍋使用過后，需將鍋內(nèi)剩余的水倒掉，使鍋內(nèi)保持干燥，以免日久腐蝕，并做好各項(xiàng)安全檢查后方能離開。

將上述培養(yǎng)基以0.105MPa，20min高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌則應(yīng)放入冰箱內(nèi)保存，但切記時(shí)間不宜過久。

拿出培養(yǎng)基后，按實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行制作斜面、平板等。若需制成斜面，則試管應(yīng)傾斜放置，冷卻后即制成（參見圖3-2）；做穿刺用的固體或半固體培養(yǎng)基，試管應(yīng)直立放置；制作成平板的，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入15～20mL ，倒入后可以在平整的實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上順時(shí)針或逆時(shí)針搖勻，搖勻時(shí)注意不要將里面的培養(yǎng)基濺出（參見圖3-3）。

圖 3-2 斜面培養(yǎng)基的制作 

圖3-3 將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)

11) 鑒定：將消毒冷卻后的培養(yǎng)基置于 37 ℃恒溫箱內(nèi) 培養(yǎng)24-48h后觀察有無雜菌生長，如無雜菌生長則可接入微生物菌種，經(jīng)培養(yǎng)后觀察微生物生長發(fā)育情況，以便確定培養(yǎng)基是否合于實(shí)驗(yàn)要求。

12) 保存：經(jīng)驗(yàn)定合格的培養(yǎng)基，可存放于冰箱（4 ℃左右）內(nèi)或暗涼處清潔的柜內(nèi)，避免干燥、氧化、pH 值的改變和雜菌的污染，這樣保存數(shù)星期仍然可用。但不宜保存時(shí)間過久，以少量勤做為宜。

5. 注意事項(xiàng)

（1）稱藥品用的各種藥匙不要混用；稱完藥品應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋，瓶蓋切莫張冠李戴，尤其是易吸潮的蛋白胨等更應(yīng)注意及時(shí)蓋緊瓶塞與旋緊瓶蓋。

（2）調(diào)pH時(shí)要小心操作，盡量避免回調(diào)而帶入過多的無機(jī)離子。

（3）配制半固體或固體培養(yǎng)基時(shí)，瓊脂的用量應(yīng)根據(jù)市售瓊脂的牌號(hào)而定，否則培養(yǎng)基的軟硬程度也會(huì)影響某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果。